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非洲豬瘟病毒DNA檢測方案

1.常見樣本類型：

分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結等樣本中的非洲豬瘟。

2.. 樣品預處理方式（樣本處理區）

2.1 樣本前處理

2.1.1組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取

0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心2min，取上清液 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；病樣組織直接上機提取也有實驗室在用（江蘇泰州農委）

2.1.2全血樣本：取全血離心后的上清（血清） 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

相關實驗設備：動物組織研磨儀、手持式電動組織研磨儀

根據樣本數量多少可用高通量組織破碎儀或者手持式組織研磨儀破碎組織樣本，之后用離心機將樣本離心分層，取上清液。

2.2樣本保存和運輸

上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 藍冰和干冰運輸，嚴禁反復凍融。

2.3 DNA 提取

對上述處理好的標本加入到預裝好提取試劑的96深孔板中，將加好樣本的耗材放置到96全自動核酸提取儀中提取核酸。

96全自動核酸提取儀用于病毒核酸的提取，配套提取試劑可以以散裝形式提供，也可以以預裝的形式提供，96高通量移液工作站可以用于散裝試劑的分裝。

3. 試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，將上游引物、下游引物、熒光定量探針、酶液預混好，將混合好反應液分裝到 PCR 反應管中。舉例如下：

4. 加樣（樣本處理區）

將提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取一定量，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

5. PCR 擴增（核酸擴增區）

5.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

5.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 20μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

5.3 相關設備：

BTK-6 熒光PCR儀、BTK-10 超快速熒光PCR儀、ABI7500、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

6. 結果分析判定

按照非洲豬瘟核酸檢測試劑盒指導進行判讀。

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